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1、(10)申请公布号 CN 103097526 A (43)申请公布日 2013.05.08 CN 103097526 A *CN103097526A* (21)申请号 201180039282.0 (22)申请日 2011.06.09 61/352,959 2010.06.09 US C12N 9/12(2006.01) (71)申请人 达纳法伯癌症研究所公司 地址 美国马萨诸塞州 (72)发明人 LA加拉维 C埃默里 N沃格尔 (74)专利代理机构 中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人 梁谋 (54) 发明名称 赋予针对RAF和MEK抑制剂的抗性的MEK1突 变 (57) 摘要。
2、 本发明提供了具有突变型 MEK 序列的核酸和 蛋白质， 和涉及鉴定对于用抗癌剂特别是 RAF 或 MEK 的抑制剂的治疗具有抗性的患者的方法。还 提供了治疗和用于最佳化用于在 MEK1 序列中具 有突变的患者的治疗的方法。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2013.02.08 (86)PCT申请的申请数据 PCT/US2011/039789 2011.06.09 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/156588 EN 2011.12.15 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 44 页 序列表 11 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识。
3、产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书44页 序列表11页 附图4页 (10)申请公布号 CN 103097526 A CN 103097526 A *CN103097526A* 1/2 页 2 1. 一种编码具有 MEK1 活性的突变型 MEK1 蛋白质的分离核酸分子， 其中所述突变型 MEK1 蛋白质包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 的位置 121 上的氨基酸置换， 该氨 基酸置换对表达该突变型 MEK1 蛋白质的细胞赋予针对一种或多种 RAF 或 MEK 抑制剂的抗 性。 2. 权利要求 1 的核酸分子， 其中该 RAF 抑制剂选自 PLX472。
4、0、 PLX4032、 BAY 43-9006 （索 拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 AAL-881、 LBT-613 和 CJS352。 3. 权利要求 1 的核酸分子， 其中该 MEK 抑制剂选自 CI-1040、 AZD6244、 PD318088、 PD98059、 PD334581、 RDEA119、 化合物 A 和化合物 B。 4. 权利要求 1 的核酸分子， 其中该氨基酸置换是 121CS 氨基酸置换。 5. 权利要求 1 的核酸分子， 其中该突变型 MEK1 蛋白质包含 SEQ ID NO ： 4 的氨基酸序 列。 6. 权利要求 1 的核酸分子， 其包含。
5、 SEQ ID NO ： 3 的核苷酸序列。 7. 一种表达载体， 其包含权利要求 1-6 中任一项的核酸。 8. 一种宿主细胞， 其包含权利要求 7 的表达载体。 9. 一种产生突变型 MEK1 蛋白质的方法， 其包括培养权利要求 8 的宿主细胞， 从而使得 该细胞产生突变型 MEK1 蛋白质。 10. 一种具有 MEK1 活性的分离的突变型 MEK1 蛋白质， 其中所述突变型 MEK1 蛋白质包 含在SEQ ID NO ： 2中所示的野生型MEK1蛋白质的位置121上的氨基酸置换， 该氨基酸置换 对表达该突变型 MEK1 蛋白质的细胞赋予针对一种或多种 RAF 或 MEK 抑制剂的抗性。 。
6、11. 权利要求 10 的突变型 MEK1 蛋白质， 其中该 RAF 抑制剂选自 PLX4720、 PLX4032、 BAY 43-9006（索拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 AAL-881、 LBT-613 和 CJS352。 12. 权利要求 10 的突变型 MEK1 蛋白质， 其中该 MEK 抑制剂选自 CI-1040、 AZD6244、 PD318088、 PD98059、 PD334581、 RDEA119、 化合物 A 和化合物 B。 13. 权利要求 10 的突变型 MEK1 蛋白质， 其中该氨基酸置换是 121CS 氨基酸置换。 14. 权利要求 10 的。
7、突变型 MEK1 蛋白质， 其包含 SEQ ID NO ： 4 的氨基酸序列。 15. 一种将具有癌症的受试者鉴定为在用 RAF 抑制剂的治疗过程中具有高复发风险的 方法， 其包括 ： （a） 从该癌症的细胞中提取核酸 ； 和 （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 其中与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 产生该 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷 酸的存在， 将该受试者鉴定为在用 RAF 抑制剂的治疗过程中具有高复发风险。 16. 一种将具有癌症的受试者鉴定为不响应用 RAF 抑制剂的治疗的方法， 其包括 ： （a） 从该癌症的细胞中提取核酸 ； 和 （b） 测序编。
8、码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 其中与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 产生该 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷 酸的存在， 将该受试者鉴定为不响应用 RAF 抑制剂的治疗。 17. 一种最佳化具有癌症的受试者的治疗的方法， 其包括 ： （a） 从该癌症的细胞中提取核酸 ； 和 （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 权 利 要 求 书 CN 103097526 A 2 2/2 页 3 其中与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 产生该 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷 酸的存在， 指示需要用 RAF 抑制剂和 MEK 抑制剂治疗该受试者， 其中该。
9、 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋白质。 18. 一种治疗具有癌症的受试者的方法， 其包括 ： （a） 从该癌症的细胞中提取核酸 ； （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 和 （c） 与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 当该核酸分子含有产生该 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷酸时， 给该受试者施用RAF抑制剂和施用靶向具有121CS氨基酸置换的 突变型 MEK1 蛋白质的 MEK 抑制剂。 19. 一种治疗具有癌症的受试者的方法， 其包括 ： （a） 从该癌症的细胞中提取核酸 ； （b） 对样品实施 PCR 和鉴定编码 MEK1。
10、 蛋白质的核酸分子的核苷酸序列 ； （c） 与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 当该核酸分子含有产生该 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷酸时， 给该受试者施用RAF抑制剂和施用靶向具有121CS氨基酸置换的 突变型 MEK1 蛋白质的 MEK 抑制剂。 20.一种鉴定具有癌症的受试者的方法， 该受试者可能获益于用RAF抑制剂和MEK抑制 剂的治疗， 该 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋白质， 该方法包括 ： （a） 检测得自该癌症的核酸样品中编码 MEK1 蛋白质的核酸分子中一个或多个突变的 存在， 与野生型MEK1蛋白质相比较， 该突变产。
11、生该MEK1蛋白质中的121CS氨基酸置换 ； 和 （b） 使编码MEK1蛋白质的核酸分子中一个或多个突变的存在与可能获益于用RAF抑制 剂和 MEK 抑制剂的治疗的受试者关联， 该突变产生该 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换， 且该 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋白质。 21. 一种鉴定具有癌症的受试者的方法， 该受试者可能获益于用 MEK 抑制剂的治疗， 该 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋白质， 该方法包括 ： （a） 从该癌症的细胞中提取核酸 ； 和 （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 。
12、其中与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 产生该 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷 酸的存在， 将受试者鉴定为可能获益于用MEK抑制剂的治疗， 该MEK抑制剂靶向具有121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋白质。 22. 权利要求 15-21 中任一项的方法， 其中该 RAF 抑制剂选自 PLX4720、 PLX4032、 BAY 43-9006（索拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 AAL-881、 LBT-613 和 CJS352。 23. 权利要求 22 的方法， 其中该 RAF 抑制剂是 PLX4720 或 PLX4032。 24. 权利要求 15。
13、-21 中任一项的方法， 其中该癌症是黑素瘤。 25. 权利要求 15-21 中任一项的方法， 其中该癌症选自白血病、 淋巴瘤、 骨髓瘤、 癌、 转 移性癌、 肉瘤、 腺瘤、 神经系统癌症和泌尿生殖系癌。 权 利 要 求 书 CN 103097526 A 3 1/44 页 4 赋予针对 RAF 和 MEK 抑制剂的抗性的 MEK1 突变 0001 相关申请 本申请根据 35 U.S.C. 119（e） 要求于 2010 年 6 月 9 日提交的临时美国专利申请 序列号 61/352,959 的提交日期的利益， 其整体通过引用合并入本文。 0002 联邦赞助的研究或开发 本发明在由美国国立卫生研。
14、究院授予的联邦资助号K08 CA115927下由政府支持进行。 政府在本发明中拥有一定权利。 0003 发明背景 癌症治疗是现代医学中的最大挑战之一。 虽然化学治疗剂是治疗或减少与癌症相关的 症状的典型的有效方法， 但在一些情况下， 针对一种或多种化学治疗剂的抗性在治疗过程 中表现。因此， 给定的化学治疗剂可以在特定个体中变得无效。对负责多个类型癌症中的 抗性发展的分子机制理解很少。阐明作为针对特定试剂的抗性的基础的机制， 是开发有效 避免药物抗性的治疗方法必需的。 0004 特别地， 需要另外的治疗方法的一类癌症是恶性黑素瘤。恶性黑素瘤是美国中第 六大最常见的癌症诊断， 在 2009 年， 。
15、估计的新病例有 68,729 个。转移性黑素瘤与极差的预 后相关， 具有 6 15 个月的生存中值。在黑素瘤中， MAP 激酶途径不受控制的活性是几乎 遍在的， 且最通常通过功能获得的突变发生， 涉及 BRAF 癌基因 （BRAF V600E） 的密码子 600。 超过 50% 的转移性黑素瘤具有 BRAF V600E 突变。此外， BRAF V600E 突变已在 10% 的结肠 直肠癌和 8% 的所有实体瘤中发现。 0005 近来， 特异性靶向黑素瘤中的突变 BRAF 的努力已获得有希望的结果。PLX4032 是 特异性抑制 BRAF V600E 的经口靶向药物。在具有 BRAF V600E。
16、 突变的黑素瘤患者的 1 期试 验中， 70% 的患者 （27 个中的 19 个） 按照 RECIST 标准具有至少 30% 肿瘤应答。PLX4032 的 II期和III期试验目前在进行中。 然而， 与所有其它靶向治疗一样， 针对PLX4032的抗性已 开始出现， 患者在平均 9 个月后复发。 0006 发明概述 本发明涉及突变介导的针对癌症的化学治疗的抗性。在特定的实施方案中， 本发明涉 及在 MEK1 蛋白质和编码 MEK1 蛋白质的核酸分子中鉴定的突变， 其中所述突变包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的氨基酸位置 121 上的置换。该突变赋予针对目前 在。
17、治疗使用中的 RAF 和 MEK 抑制剂的抗性。该突变的鉴定允许鉴定出可能受对化学治疗剂 的抗性敏感的癌症患者。此外， 该突变的鉴定允许开发第二代 MEK 抑制剂， 其显示出针对含 有抗性突变例如本文描述的突变的 MEK1 蛋白质的活性。此类第二代 MEK 抑制剂在许多临 床和治疗应用包括癌症的治疗中是有用的。 0007 相应地， 在第一个方面， 本发明的特征在于编码具有MEK1活性的突变型MEK1蛋白 质的分离核酸分子， 其中所述突变型MEK1蛋白质包含在SEQ ID NO ： 2中所示的野生型MEK1 的位置 121 上的氨基酸置换， 所述氨基酸置换对表达所述突变型 MEK1 蛋白质的细胞。
18、赋予 针对一种或多种 RAF 或 MEK 抑制剂的抗性。在多个实施方案中， RAF 抑制剂选自 PLX4720、 PLX4032、 BAY 43-9006（索拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 AAL-881、 LBT-613 和 CJS352。优 说 明 书 CN 103097526 A 4 2/44 页 5 选的 RAF 抑制剂是 BRAF 抑制剂 PLX4720 和 PLX4032。在多个实施方案中， MEK 抑制剂选自 CI-1040、 AZD6244、 PD318088、 PD98059、 PD334581、 RDEA119、 化合物 A 和化合物 B。在某些实 施。
19、方案中， MEK 抑制剂是 MEK1 抑制剂 AZD6244。在某些实施方案中， 氨基酸置换是 121CS 氨基酸置换。在某些实施方案中， 突变型 MEK1 蛋白质包含 SEQ ID NO ： 4 的氨基酸序列。在 某些实施方案中， 核酸包含 SEQ ID NO ： 3 的核苷酸序列。 0008 编码突变型 MEK1 蛋白质的分离核酸分子可以插入表达载体内且在宿主细胞中表 达。相应地， 在另一个方面， 本发明的特征在于包含如本文所述的核酸分子的表达载体。在 另一个方面， 本发明的特征在于包含前述表达载体的宿主细胞。 在另一个方面， 本发明的特 征在于产生突变型 MEK1 蛋白质的方法， 其包括。
20、培养包含编码突变型 MEK1 蛋白质的表达载 体的宿主细胞， 从而使得突变型 MEK 蛋白质由该细胞产生。 0009 在其他方面， 本发明的特征在于具有MEK1活性的分离突变型MEK1蛋白质， 其中所 述突变型 MEK1 蛋白质包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨 基酸置换， 所述氨基酸置换对表达所述突变型 MEK1 蛋白质的细胞赋予针对一种或多种 RAF 或 MEK 抑制剂的抗性。在多个实施方案中， RAF 抑制剂选自 PLX4720、 PLX4032、 BAY 43-9006 （索拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 A。
21、AL-881、 LBT-613 和 CJS352。在某些实施方案中， RAF 抑制剂是 BRAF 抑制剂 PLX4720 和 PLX4032。在多个实施方案中， MEK 抑制剂选自 CI-1040、 AZD6244、 PD318088、 PD98059、 PD334581、 RDEA119、 化合物 A 和化合物 B。在某些实施方案 中， MEK 抑制剂是 MEK1 抑制剂 AZD6244。在某些实施方案中， 氨基酸置换是 121CS 氨基酸 置换。在某些实施方案中， 突变型 MEK1 蛋白质包含 SEQ ID NO ： 4 的氨基酸序列。 0010 在另一个方面， 本发明的特征在于鉴定在治疗。
22、癌症中有用的化合物的方法， 其包 括 ： 提供包含突变型MEK1蛋白质的测定组合物， 其中所述突变型MEK1蛋白质包含在SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨基酸置换， 和 MEK1 底物 ； 在不存在测 试化合物的情况下， 在允许 MEK1 底物磷酸化的条件下使测定组合物与测试化合物接触 ； 和 测定化合物对 MEK1 底物的磷酸化的作用 ； 其中与合适对照相比较， MEK1 底物的磷酸化的下 调将该化合物鉴定为在治疗癌症中有用的化合物。在某些实施方案中， 突变型 MEK1 蛋白质 包含 121CS 氨基酸置换。 0011 在相关方面， 本发明的特。
23、征在于将化合物鉴定为第二代 MEK1 抑制剂的方法， 其包 括 ： 提供包含突变型MEK1蛋白质的测定组合物， 其中所述突变型MEK1蛋白质包含在SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨基酸置换， 和 MEK1 底物 ； 在不存在测 试化合物的情况下， 在允许 MEK1 底物磷酸化的条件下使测定组合物与测试化合物接触 ； 和 测定化合物对 MEK1 底物的磷酸化的作用 ； 其中与合适对照相比较， MEK1 底物的磷酸化的 下调将该化合物鉴定为第二代 MEK1 抑制剂。在某些实施方案中， 突变型 MEK1 蛋白质包含 121CS 氨基酸置换。 0012 。
24、在前述方面的示例性实施方案中， MEK1 底物是 ERK1/2。在其它实施方案中， 测定 组合物是细胞提取物。 0013 在另一个方面， 本发明的特征在于鉴定在治疗癌症中有用的化合物的方法， 其包 括 ： 提供包含突变型MEK1蛋白质的细胞， 其中所述突变型MEK1蛋白质包含在SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨基酸置换 ； 使细胞与测试化合物接触 ； 和测 定化合物对 ERK1/2 磷酸化的作用 ； 其中与合适对照相比较， ERK1/2 磷酸化的下调将该化合 说 明 书 CN 103097526 A 5 3/44 页 6 物鉴定为在治疗癌症中有用。
25、的化合物。在相关方面， 本发明提供了鉴定其为第二代 MEK1 抑 制剂的化合物的方法， 其包括 ： 提供包含突变型 MEK1 蛋白质的细胞， 其中所述突变型 MEK1 蛋白质包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨基酸置换 ； 使 细胞与测试化合物接触 ； 和测定化合物对 ERK1/2 磷酸化的作用 ； 其中与合适对照相比较， ERK1/2 磷酸化的下调将该化合物鉴定为第二代 MEK1 抑制剂。对于这两种方法的某些实施 方案中， 突变型 MEK1 蛋白质包含 121CS 氨基酸置换。 0014 在另一个方面， 本发明的特征在于鉴定在治疗癌症中有。
26、用的化合物的方法， 其包 括 ： 提供包含突变型MEK1蛋白质的细胞， 其中所述突变型MEK1蛋白质包含在SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨基酸置换 ； 使细胞与测试化合物接触 ； 和测 定化合物对细胞增殖的作用 ； 其中与合适对照相比较， 细胞增殖的减少将该化合物鉴定为 在治疗癌症中有用的化合物。在相关方面， 本发明提供了鉴定其为第二代 MEK1 抑制剂的化 合物的方法， 其包括 ： 提供包含突变型 MEK1 蛋白质的细胞， 其中所述突变型 MEK1 蛋白质包 含在SEQ ID NO ： 2中所示的野生型MEK1蛋白质的位置121上的氨基酸置换。
27、 ； 使细胞与测试 化合物接触 ； 和测定化合物对细胞增殖的作用 ； 其中与合适对照相比较， 细胞增殖的减少 将该化合物鉴定为第二代 MEK1 抑制剂。对于这两种方法的某些实施方案， 突变型 MEK1 蛋 白质包含 121CS 氨基酸置换。 0015 在另一个方面， 本发明的特征在于用于将测试化合物鉴定为第二代 MEK1 抑制剂 的基于细胞的筛选方法， 该方法包括使宿主细胞与测试化合物接触， 其中所述宿主细胞包 含突变型 MEK1 蛋白质， 其中所述突变型 MEK1 蛋白质包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨基酸置换， 其中宿主细胞对测试化。
28、合物的敏感性将该化合物 鉴定为第二代 MEK1 抑制剂。在这个方面的一个实施方案中， 宿主细胞对测试化合物的敏感 性使用选自下述的测定进行测量 ： 细胞增殖测定、 细胞生存力测定和 ERK1/2 磷酸化测定， 其中在测试化合物的存在下， 细胞增殖、 细胞生存力或 ERK1/2 磷酸化的减少将该化合物鉴 定为第二代MEK1抑制剂。 在某些实施方案中， 突变型MEK1蛋白质包含121CS氨基酸置换。 0016 在另一个方面， 本发明的特征在于鉴定第二代 MEK1 抑制剂的方法， 其包括 ： 使用 由突变型 MEK1 蛋白质的三维晶体或溶液结构的计算机辅助建模选择潜在药物， 其中所述 突变型 MEK。
29、1 蛋白质包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨 基酸置换 ； 使所述潜在药物与突变型MEK1蛋白质接触 ； 和检测所述潜在药物与突变型MEK1 蛋白质的相互作用 ； 其中能够与突变型 MEK1 蛋白质相互作用的化合物被鉴定为第二代 MEK1 抑制剂。在某些实施方案中， 突变型 MEK1 蛋白质包含 121CS 氨基酸置换。 0017 在前述方面的一个实施方案中， 测试化合物是化合物文库的成员。 0018 在另一个方面， 本发明的特征在于通过前述方法之一鉴定的化合物。此类化合 物在例如抑制突变型 MEK1 蛋白质的活性中是有用的， 所述突变型。
30、 MEK1 蛋白质包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨基酸置换， 在某些实施方案中为 121CS 氨基酸置换。相应地， 在另一个方面， 本发明的特征在于抑制突变型 MEK1 蛋白质的 活性的方法， 其中所述突变型 MEK1 蛋白质包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白 质的位置 121 上的氨基酸置换 （优选 121CS 氨基酸置换） ， 该方法包括使突变型 MEK1 蛋白 质与根据前述方法之一鉴定的化合物接触。在示例性实施方案中， 化合物抑制突变型 MEK1 蛋白质和野生型 MEK1 蛋白质的活性。在一个实施方。
31、案中， 所述接触在体外发生。在另一个 说 明 书 CN 103097526 A 6 4/44 页 7 实施方案中， 所述接触在体内发生。在另一个实施方案中， 所述接触在受试者中发生。在示 例性实施方案中， 所述接触在具有癌症的受试者中发生。在一个实施方案中， 具有癌症的 受试者已从用 RAF 抑制剂的治疗复发， 例如选自下述的 RAF 抑制剂 ： PLX4720、 PLX4032、 BAY 43-9006（索拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 AAL-881、 LBT-613 和 CJS352（优选 BRAF 抑制 剂 PLX4720 和 PLX4032） 。另外或可替代地，。
32、 具有癌症的受试者已从用第一代 MEK 抑制剂的 治疗复发， 例如选自下述的 MEK 抑制剂 ： CI-1040、 AZD6244、 PD318088、 PD98059、 PD334581、 RDEA119、 化合物 A 和化合物 B。在某些实施方案中， MEK1 抑制剂是 AZD6244。在示例性实 施方案中， 癌症是黑素瘤。 0019 在另一个方面， 本发明的特征在于治疗具有癌症的受试者的方法， 其包括给受试 者施用根据前述方法之一鉴定的化合物。在示例性实施方案中， 化合物抑制突变型 MEK1 蛋 白质的活性， 其包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 。
33、121 上的氨基酸 置换 （优选 121CS 氨基酸置换） ， 和野生型 MEK1 蛋白质。在一个实施方案中， 具有癌症的 受试者已从用 RAF 抑制剂的治疗复发， 例如选自下述的 RAF 抑制剂 ： PLX4720、 PLX4032、 BAY 43-9006（索拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 AAL-881、 LBT-613 和 CJS352。在某些实施方案 中， BRAF 抑制剂选自 PLX4720 和 PLX4032。另外或可替代地， 具有癌症的受试者已从用第 一代 MEK 抑制剂的治疗复发， 例如选自下述的 MEK 抑制剂 ： CI-1040、 AZD6244、 。
34、PD318088、 PD98059、 PD334581、 RDEA119、 化合物 A 和化合物 B。在某些实施方案中， MEK1 抑制剂是 AZD6244。在特定实施方案中， 癌症包含就野生型 MEK1 蛋白质而言具有 121CS 氨基酸置换 的 MEK1 蛋白质， 和 / 或编码就野生型 MEK1 蛋白质而言具有 121CS 氨基酸置换的 MEK1 蛋 白质的 MEK1 核酸分子， 其中所述 121CS 氨基酸置换对表达所述突变型 MEK1 蛋白质的细胞 赋予针对一种或多种 RAF 或 MEK 抑制剂的抗性。在示例性实施方案中， 癌症是黑素瘤。 0020 在另一个方面， 本发明的特征在于筛。
35、选具有癌症的受试者的方法， 该方法包括从 受试者获得含有癌细胞的样品 ； 和测定在含有癌细胞的样品中， 在 SEQ ID NO ： 2 中所示的 野生型 MEK1 蛋白质的位置 121 上的氨基酸置换的存在或不存在。在某些实施方案中， 测定 121CS 氨基酸置换的存在或不存在。 0021 在前述方面的一个实施方案中， 在 MEK1 蛋白质的位置 121 上突变的检测将受试 者鉴定为在用 RAF 抑制剂的治疗过程中具有相对高的复发风险。在另一个实施方案中， 在 MEK1蛋白质的位置121上突变的检测将受试者鉴定为不响应用RAF抑制剂的治疗。 在示例 性实施方案中， RAF 抑制剂选自 PLX4。
36、720、 PLX4032、 BAY 43-9006（索拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 AAL-881、 LBT-613 和 CJS352。在某些实施方案中， BRAF 抑制剂选自 PLX4720 和 PLX4032。在前述方面的另一个实施方案中， 在 MEK1 蛋白质中的位置 121 上突变的存在 （优 选 C121S） 将受试者分层至用靶向突变型 MEK1 蛋白质的第二代 MEK1 抑制剂的治疗。在另 一个实施方案中， 在MEK1蛋白质中的位置121上突变的存在将受试者分层至用组合疗法的 治疗， 所述组合疗法包括给予 RAF 抑制剂和靶向突变型 MEK1 蛋白质的第二代。
37、 MEK1 抑制剂。 在某些实施方案中， 在位置 121 上的突变是 C121S。 0022 在另一个方面， 本发明提供了将具有癌症的受试者鉴定为在用 RAF 抑制剂的治疗 过程中具有高复发风险的方法， 其包括 ： （a） 从癌症的细胞中提取核酸 ； 和 （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 说 明 书 CN 103097526 A 7 5/44 页 8 其中与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 产生 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷酸 的存在将受试者鉴定为在用 RAF 抑制剂的治疗过程中具有高复发风险。 0023 在另一个方面， 本发明提供了将具有癌症的受试者鉴定。
38、为不响应用 RAF 抑制剂的 治疗的方法， 其包括 ： （a） 从癌症的细胞中提取核酸 ； 和 （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 其中与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 产生 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷酸 的存在将受试者鉴定为不响应用 RAF 抑制剂的治疗。 0024 在另一个方面， 本发明提供了最佳化具有癌症的受试者的治疗的方法， 其包括 ： （a） 从癌症的细胞中提取核酸 ； 和 （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 其中与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 产生 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷酸 的存在指示需要用 RA。
39、F 抑制剂和 MEK 抑制剂治疗受试者， 所述 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋白质。 0025 在另一个方面， 本发明提供了治疗具有癌症的受试者的方法， 其包括 ： （a） 从癌症的细胞中提取核酸 ； （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 和 （c） 与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 当核酸分子含有产生 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基 酸置换的核苷酸时， 给受试者施用RAF抑制剂和靶向具有121CS氨基酸置换的突变型MEK1 蛋白质的 MEK 抑制剂。 0026 在另一个方面， 本发明提供了治疗具有癌症的受试者的方法， 其包括 ： （。
40、a） 从癌症的细胞中提取核酸 ； （b） 对样品实施 PCR 且鉴定编码 MEK1 蛋白质的核酸分子的核苷酸序列 ； 和 （c） 与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 当核酸分子含有产生 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基 酸置换的核苷酸时， 给受试者施用RAF抑制剂和靶向具有121CS氨基酸置换的突变型MEK1 蛋白质的 MEK 抑制剂。 0027 在另一个方面， 本发明提供了鉴定具有癌症的受试者的方法， 所述受试者可能获 益于用 RAF 抑制剂和 MEK 抑制剂的治疗， 所述 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置换的突 变型 MEK1 蛋白质， 所述方法包括 ： （a） 就编码 。
41、MEK1 蛋白质的核酸分子中一个或多个突变的存在测定得自癌症的核酸样 品， 与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 所述核酸分子产生 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换 ； 和 （b） 使编码MEK1蛋白质的核酸分子中一个或多个突变的存在与可能获益于用RAF抑制 剂和 MEK 抑制剂的治疗的受试者关联， 所述核酸分子产生 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸 置换， 所述 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋白质。 0028 在另一个方面， 本发明提供了鉴定具有癌症的受试者的方法， 所述受试者可能获 益于用 MEK 抑制剂的治疗， 所述 MEK 抑制剂。
42、靶向具有 121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋 白质， 所述方法包括 ： （a） 从癌症的细胞中提取核酸 ； 和 说 明 书 CN 103097526 A 8 6/44 页 9 （b） 测序编码 MEK1 蛋白质的核酸分子 ； 其中与野生型 MEK1 蛋白质相比较， 产生 MEK1 蛋白质中的 121CS 氨基酸置换的核苷酸 的存在将受试者鉴定为可能获益于用 MEK 抑制剂的治疗， 所述 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置换的突变型 MEK1 蛋白质。 0029 在前述方面的多个实施方案中， RAF 抑制剂选自 PLX4720、 PLX4032、 BAY 43-9006 （索。
43、拉非尼） 、 ZM 336372、 RAF 265、 AAL-881、 LBT-613 和 CJS35。在某些实施方案中， RAF 抑 制剂是 PLX4720 或 PLX4032。在前述方面的某些实施方案中， 癌症是白血病、 淋巴瘤、 骨髓 瘤、 癌、 转移性癌症、 肉瘤、 腺瘤、 神经系统癌症或泌尿生殖系 （geritourinary） 癌。在示例 性实施方案中， 癌症是黑素瘤。 0030 在另一个方面， 本发明提供了用于下述的试剂盒 ： 鉴定在用 RAF 抑制剂的治疗过 程中具有高复发风险的具有癌症的受试者， 或用于鉴定不响应用 RAF 抑制剂的治疗的具有 癌症的受试者， 或用于最佳化具有。
44、癌症的受试者的治疗， 或用于鉴定可能获益于用 RAF 抑 制剂和 MEK 抑制剂的治疗的具有癌症的受试者， 所述 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸置 换的突变型 MEK1 蛋白质， 或用于鉴定可能获益于用 MEK 抑制剂的治疗的具有癌症的受试 者， 所述 MEK 抑制剂靶向具有 121CS 氨基酸的突变型 MEK1 蛋白质， 所述试剂盒包含 ：（a） 对于鉴定在 SEQ ID NO:1 或 SEQ ID NO:2 的 MEK1 蛋白质中的氨基酸位置 121 上突变的存 在或不存在有用的检测试剂 ； 和 （b） 描述如本文所示方法的说明书。在示例性实施方案中， 检测试剂包含对于扩增 S。
45、EQ ID NO ： 1 或 2 的 MEK1 蛋白质有用的核酸引物。 0031 在前述方面的多个实施方案中， 通过包括测定编码 MEK1 蛋白质的核酸分子序列 的方法， 测定MEK1蛋白质 （例如在含有癌细胞的样品中的MEK1蛋白质） 中的氨基酸位置121 上突变 （例如 C121S 突变） 的存在。在其它实施方案中， 使用识别包含该突变的 MEK1 蛋白质 的抗体测定 MEK1 蛋白质中的氨基酸位置 121 上突变的存在。在另一个实施方案中， 前述方 法进一步包括给给予在其中检测到 MEK1 蛋白质中一个或多个突变的存在的受试者根据本 文描述的方法鉴定的化合物。 0032 在另一个方面， 。
46、本发明的特征在于抑制受试者中的突变型 MEK1 蛋白质的方法， 所 述突变型 MEK1 蛋白质包含在 SEQ ID NO ： 2 中所示的野生型 MEK1 蛋白质的位置 21 上的氨 基酸置换， 所述方法包括给给予在其中检测到突变型 MEK1 蛋白质的存在的受试者通过前 述方法之一鉴定的化合物。在某些实施方案中， 氨基酸置换是 121CS 氨基酸置换。 0033 附图简述 图 1A 和 1B 是显示用增加浓度 （以 M 表示） 的 BRAF 抑制剂 PLX4720 （图 1A） 或 MEK1 抑 制剂AZD6244 （图1B） 处理的A375黑素瘤细胞的生长抑制百分比的曲线图， 其中所述A37。
47、5细 胞是未转染的 （A375） 、 用野生型 MEK1 （MEK-WT） 转染的、 用 MEK1 C121S 突变型 （MEK-C121S） 转染的或用组成性活性 MEK 变体 （MEK-DD） 转染的。 0034 图 2A 和 2B 显示了与野生型 MEK1（MEK-WT） 和组成性活性 MEK 变体 （MEK-DD） 相 比较， MEK1 C121S 突变型的激酶活性。图 2A 是免疫印迹的照片。图 2B 是定量磷酸化 ERK （pERK） 的相对百分比的柱形图。 0035 图 3 描 述 了 野 生 型 人 MEK1 核 酸 序 列 （SEQ ID NO:1） （登 记 号 NM_00。
48、2755 ； gi:169790828） 。 0036 图 4 描述了野生型人 MEK1 蛋白质序列 （SEQ ID NO:2） （登记号 NP_002746 ； 说 明 书 CN 103097526 A 9 7/44 页 10 gi:5579478） 。 0037 发明详述 本发明涉及针对用于癌症的化学治疗疗法的抗性， 特别是用 RAF 抑制剂治疗恶性黑素 瘤中的抗性的发展。本文描述的是具有转移性黑素瘤的患者， 其在最初急剧应答后发展出 针对 BRAF 抑制剂 PLX4032 的抗性。如实施例 1 中所述， 大规模平行测序用于对来自患者的 3 个不同 DNA 样品进行比较基因组分析 ：（i）。
49、 对 PLX4032 敏感的肿瘤，（ii） 对 PLX4032 抗性 的肿瘤， 和 （iii） 正常皮肤。在氨基酸位置 121 上的 MEK1 突变， 特别是 C121S 突变， 鉴定为 赋予在表达突变型 MEK1 蛋白质的细胞上针对 RAF 抑制剂的抗性， 以及针对 MEK 抑制剂的抗 性。因此， 响应 BRAF 抑制发展出的 MEK1 突变代表在具有获得性抗性机制的患者中的第一 个报道例子， 其中肿瘤在靶激酶下游发展出激活突变。 0038 在示例性实施方案中， 在 MEK1 蛋白质中的氨基酸位置 121 上的突变赋予针对 RAF 抑制剂 PLX4032 和 PLX4720 的抗性， 以及针对 MEK 抑制剂 AZD6244 的抗性。相应地， 如本文 使用的，“抗性突变” 是 MEK1 蛋白质中的突变， 其赋予针对一种或多种 RAF 或 MEK 抑制剂的 抗性。如本文使用的， 术语 “针对一种或多种 RAF 或 MEK 抑制剂的抗性” 意指抗性可以是针 对一种或多种 RAF 抑制剂、 一种或多种 MEK 抑制剂、 或 RAF 和 MEK 抑制剂的组合 （例如 RAF 抑制剂和 MEK 抑制剂） 。 0039 。
